一种新型的生物体内蛋白质组学研讨要领

公布工夫:2017-05-19 11:39     文章泉源:medical research     作者:milo -K7

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植物生长发育依赖于蛋白质正在特定构造中表达和这些蛋白质正在特定亚细胞构造中的定位。卵白的构造表达及亚细胞定位,对其功用至关重要。正果云云,曾经竖立了几个要领研究生物体内蛋白质定位。详细以下:

手艺 长处 瑕玷
荧光卵白符号 具有较好的空间及时间分辨率。能用于活体植物 转基因植物繁殖率低,检出有限
构造剖解 适用于野生型植物 敏感度不敷,仅适用于可以或许剖解星散的大构造
生物化学分级星散 适用于野生型植物 敏感度不敷,仅适用于可以或许星散纯化的亚细胞组分
非自然氨基酸符号 能正在特定细胞中符号全部蛋白质组 需求转基因植物。分辨率较低,不克不及停止亚细胞定位
限制性酶符号 能正在特定细胞中符号全部蛋白质组并停止亚细胞定位 需求转基因植物、H2O2处置惩罚并需求使生物素酚打仗意向细胞
 
近来,限制性酶符号法获得极大生长。这种方法用大豆抗坏血酸盐过氧化物酶(soybean ascorbate peroxidase ,APX),当存在H2O2及生物素酚时,催化构成激活态酚并取蛋白质构成共价键从而天生生物素符号的蛋白质。然后,生物素符号的卵白用亲和素停止纯化,停止量谱审定。相干研讨曾经正在human cell 及fly tissues中获得胜利。作者凭据此实行道理,正在运动物体内实现了蛋白组定位。

起首,为了研讨奇丽隐杆线虫肠道(intestine)构造中蛋白质,作者构建了GFP-APX-NES 、GFP-APX-NLS转基因植物,用肠道特异性spp-5作为启动子,个中NES(nuclear export signal)、NLS(nuclear localization signal)离别示意出核旌旗灯号及审定位旌旗灯号,同时,以GFP作为阴性对比。同理天,为研讨表皮(epidermi)、体壁肌肉(body wall muscle)、环咽肌(pharyngeal muscle)中蛋白质组,只需求离别用响应的启动子dpy-7、myo-3、myo-2。
当线虫发展到L4期,用H2O2及生物素酚(biotin-phenol)处置惩罚,借助荧光显微镜,能够看到线虫体内蛋白质符号状况,效果如下图所示。

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最初,用链霉亲和素柱子纯化被生物素符号的卵白,停止量谱审定,便能得到线虫各组织特异性蛋白质组。相干审定效果统计以下。


 
参考文献:
[1] In vivo mapping of tissue- and subcellular-specific proteomes in Caenorhabditis elegans.